代表性实验方案

培养细胞的单细胞悬液的制备

高质量的单细胞悬液是流式分析的保证。按照培养细胞的特征分为悬浮培养细胞和贴壁培养细胞。由于细胞增殖可能形成大小不等的细胞团块或连接成片。如果粘连细胞过多，或者细胞碎片过多都会影响流式分析的结果，进而导致实验失败。所以制备合格的培养细胞的悬液十分重要。

培养细胞样品的制备步骤：

一、悬浮细胞

直接收集到离心管中，离心，加含有0.5% BSA的PBS清洗2次，去除细胞碎片和死细胞。之后按照实验目的直接上机检测，或者染色后再进行上机检测。

二、贴壁细胞

1. 将培养细胞培养基弃去，用PBS清洗一遍，用0.25%胰酶消化。消化时间根据室温情况而定，直至在光镜下见到贴壁细胞逐渐变圆，细胞间出现间隙为止。之后弃去消化液，加等体积的完全培养基终止消化；

2. 将细胞轻轻吹打下来，移入离心管；

3. 800-1000 rpm，离心5分钟；

4. 弃上清，用pH 7.4的PBS清洗，800-1000 rpm，离心5分钟，弃上清，重复2-3次，以出去细胞悬液中的细胞碎片；

5. 加300-500 mLPBS缓冲液，将沉淀细胞轻轻吹打重悬，上机检测，或者按照实验目的染色后检测。

实体组织单细胞悬液的制备方法

流式细胞术对于细胞的各种分析基于单细胞的基础上，因此实体组织需要先制备成单细胞悬液。根据不同实体组织成分的特点可以选择不同的分散细胞的方法，以期达到单细胞产量高、细胞损伤小的目的。在实体组织分散为单细胞的过程中，解离方法可能瞬间或持久地影响细胞的性质，因此处理不同组织时，努力摸索方法，尽可能采用对细胞损伤小、产率较高的单细胞悬液制备方法，最大限度保持细胞原有特性。常用的制备方法包括酶消化法、机械分离法和化学处理法。下面介绍几种方法的通用流程，以供参考。

（一）酶消化法

酶的作用原理主要有三方面：一是破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等，二是水解组织细胞的紧密连接结构的蛋白质，三是水解组织粘多糖物质。酶消化法是将实体组织分散为单细胞的主要方法之一。常用的酶类有：胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、溶菌酶、弹性蛋白酶等。可根据分散的组织类型确定使用的酶类。需要注意的是使用条件和影响因素（酶浓度、酶效价、作用时间、pH值）等。

酶消化法常规程序如下：

1、将组织剪碎为2-4 mm直径的碎块，置于离心管中。

2、将酶混合液1-2 mL加入离心管中，颠倒吹打混匀。

3、在恒温条件下（一般为37℃）摇床上轻柔晃动消化，消化时间根据消化的效果来决定。

4、终止消化，加入含有血清的完全培养基终止消化。依次以100 mm和70 mm的滤膜过滤，除去细胞团块，并用培养基冲洗滤膜，获得单细胞悬液。

5、低速离心（如300g 5分钟），弃去上清，加入2 mL 含有2% BSA的PBS重悬，再次低速离心，弃去上清。重复洗涤一次。

6、制备好的细胞可进行荧光标记后上机检测或保存备用。

（二）机械法

机械法适用于较为松散的组织，如脾、肝脏等。操作方法有:剪碎法、研磨法、网搓法等，最后用300目尼龙网过滤细胞得到单细胞悬液。

1、剪碎法

1)   将组织放入小皿中，加入含有2% BSA的PBS中；

2)   用剪刀将组织剪至匀浆状；

3)   加入10ml含有2% BSA的PBS；

4)   用吸管吸取组织匀浆，先以100目尼龙网过滤到试管中；

5)   1000 rpm离心4～5 min，再用含有2% BSA的PBS洗3次，每次以短时低速（500～800rpm）离心沉淀去除细胞碎片；

6)   以300目尼龙网过滤去除细胞；

7)   制备好的细胞可进行荧光标记后上机检测或保存备用。

2、研磨法

1)   先将组织剪碎成1～2 mm³小块；

2)   放入组织研磨器中加入1～2 mL 生理盐水；

3)   转动研棒，研至匀浆；

4)   加入10ml含有2% BSA的PBS，冲洗研磨器；

5)   收集细胞悬液，并经300目尼龙网过滤，500～800 rpm离心2分钟，弃上清，用含有2% BSA的PBS重悬，并重复该过程3遍；

6)   制备好的细胞可进行荧光标记后上机检测或保存备用。

3、网搓法

1)   将100目扎在小烧杯上；

2)   把剪碎的组织放在网上，用眼科镊子轻轻搓组织块，边搓边用含有2% BSA的PBS冲洗，直到将组织搓完。或使用注射器里的推杆，在网上轻碾研搓，直到将组织搓完；

3)   收集细胞悬液，用300目尼龙网过滤，收集滤出液；

4)   500～800 rpm离心2分钟，弃去上清。用含有2% BSA的PBS重悬细胞沉淀；

5)   制备好的细胞可进行荧光标记后上机检测或保存备用。

（三）化学处理法

      化学处理法的主要原理是：将组织细胞间起粘连作用的钙镁离子置换出来，从而得到单细胞悬液。

1、试剂配制

1)   0.2%EDTA配置：将0.2gEDTA溶解于100ml Hank液中，封装高压消毒，置0-4度保存。

2)   胰酶加EDTA 的配置：胰酶0.25g加PBS（pH 7.0）200 mL，浓度为0.125%，EDTA 0.2g加PBS（pH 7.0）100 mL，浓度为0.2%。各取40 mL混合，分装后置0-4度冰箱保存，使用前过滤。

2、实验方法

1)   将组织切成薄片，置于试管中；

2)   首先加入EDTA液5 mL，室温下孵育0.5小时，离心弃之；

3)   加入胰酶-EDTA液5-10 mL，置37度恒温水浴30 min，间断振荡3-5次；

4)   用300目尼龙网过滤，1000 rpm离心5分钟，弃上清。再用PBS重悬细胞，清洗2-3次，每次500-800 rpm离心1-2 min;

5)   制备好的细胞可进行荧光标记后上机检测或保存备用。

经验总结:

1、单独使用机械法和化学处理法，细胞产量较低，细胞碎片较多，细胞存活率也较低。单独使用酶消化法比较费时，对于一些有严格时间要求的实验来说不能选择，而美天旎的组织解离器和检测组织对应的解离试剂盒，是采用机械法和酶消化法相结合，可以避免各自单独使用的缺点，制备单细胞悬液的效率较高；

2、操作中细胞损伤时，DNA外泄容易造成细胞聚团的情况，在酶解液中添加DNaseI可以有效的改善这种情况。

3、操作过程中动作应轻柔，重悬细胞时轻轻吹打即可重悬。若发生细胞聚团，则弃去聚团细胞。

4、血细胞含量丰富的组织，如胰脏和肝脏，可根据需要增加裂解红细胞的步骤。

5、尽量使用新鲜制备的单细胞悬液进行检测。若无法及时检测，可以用4% PFA固定。但固定后的细胞容易破碎，需要注意。

流式凋亡检测方案

实验步骤
 1. 细胞收集：悬浮细胞直接收集到10ml的离心管中，每样本细胞数为（1~5）×106，/mL500~1000r/min离心5min，弃去培养液。
 2. 用孵育缓冲液洗涤1次，500~1000r/min离心5min。
 3. 用100ul的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育10~15min。
 4. 500~1000r/min离心5min沉淀细胞孵育缓冲液洗1次。
 5. 加入荧光（SA-FLOUS）溶液4℃下孵育20min，避光并不时振动。
 6. 流式细胞仪分析：流式细胞仪激发光波长用488nm，用一波长为515nm的通带滤器检测FITC荧光，另一波长大于560nm的滤器检测PI。
 7. 结果判断：凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（FITC-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（FITC+/PI+）；而右下象限为凋亡细胞，显现（FITC+/PI-）。

 Apoptosis is a carefully regulated process of cell death that occurs as a normal part of development. Inappropriately regulated apoptosis is implicated in disease states, such as Alzheimer’s disease and cancer. Apoptosis is distinguished from necrosis, or accidental cell death, by characteristic morphological and biochemical changes, including compaction and fragmentation of the nuclear chromatin, shrinkage of the cytoplasm, and loss of membrane asymmetry.^1-5 In normal live cells, phosphatidyl serine (PS) is located on the cytoplasmic surface of the cell membrane. However, in apoptotic cells, PS is translocated from the inner to the outer leaflet of the plasma membrane, thus exposing PS to the external cellular environment.⁶ In leukocyte apoptosis, PS on the outer surface of the cell marks the cell for recognition and phagocytosis by macrophages.^7,8 The human anticoagulant, annexin V, is a 35–36 kDa Ca²⁺-dependent phospholipid-binding protein that has a high affinity for PS.⁹ Annexin V labeled with a fluorophore or biotin can identify apoptotic cells by binding to PS exposed on the outer leaflet.¹⁰ 

The Alexa Fluor® 488 annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit with Alexa® Fluor 488 annexin V and PI for flow cytometry provides a rapid and convenient assay for apoptosis. The kit contains recombinant annexin V conjugated to one of our best and brightest fluorophores, the Alexa Fluor® 488 dye, to provide the maximum sensitivity. Alexa Fluor® 488 dye is an almost perfect spectral match to fluorescein (FITC), but it creates brighter and more photostable conjugates. 

In addition, the kit includes a ready-to-use solution of the red-fluorescent propidium iodide (PI) nucleic acid binding dye. PI is impermeant to live cells and apoptotic cells, but stains dead cells with red fluorescence, binding tightly to the nucleic acids in the cell. After staining a cell population with Alexa Fluor® 488 annexin V and PI in the provided binding buffer,apoptotic cells show green fluorescence, dead cells show red and green fluorescence, and live cells show little or no fluorescence. These populations can easily be distinguished using a flow cytometer with the 488 nm line of an argon-ion laser for excitation. 

We have optimized this assay using Jurkat cells, a human T-cell leukemia clone, treated with camptothecin to induce apoptosis. Some modifications may be required for use with other cell types. Because no single parameter defines apoptosis in all systems, we strongly suggest using a combination of different measurements for reliable detection of apoptosis. 

Materials

Table 1. Contents and storage information. 

*The Alexa Fluor® 488 annexin V and propidium iodide are light sensitive and may be handled in normal room light, but avoid prolonged exposure to light. 

Number of assays: Sufficient material is supplied for 50 flow cytometry assays based on a 100 μL assay volume. 

Approximate fluorescence excitation/emission maxima: Alexa Fluor® 488 annexin V: 488/499 in nm; Propidium iodide: 535/617 in nm, bound to DNA. 

Materials Required but Not Provided

§  Samples (appropriate sample concentrations range from 2 × 10⁵ to 1 × 10⁶ cells/mL)

§  Inducing agent

§  Phosphate buffered saline (PBS)

§  Deionized water

Flow Cytometry Protocol

1.     Induce apoptosis in cells using the desired method. Prepare a negative control by incubating cells in the absence of inducing agent. 

2.     Harvest the cells after the incubation period and wash in cold phosphate-buffered saline (PBS). 

3.     Prepare 1X annexin-binding buffer. For example, for ~10 assays, add 1 mL 5X annexin ­binding buffer (Component C) to 4 mL deionized water. 

4.     Prepare a 100 µg/mL working solution of PI by diluting 5 µL of the 1 mg/mL PI stock solution (Component B in 45 µL 1X annexin-binding buffer. Store the unused portion of this working solution for future experiments. 

5.     Re-centrifuge the washed cells (from step 2), discard the supernatant and resuspend the cells in 1X annexin-binding buffer.  Determine the cell density and dilute in 1X annexin-binding buffer to ~1 × 10⁶ cells/mL, preparing a sufficient volume to have 100 µL per assay.  

6.     Add 5 µL Alexa Fluor® 488 annexin V (Component A) and 1 µL 100 µg/mL PI working solution (prepared in step 4) to each 100 µL of cell suspension 

7.     Incubate the cells at room temperature for 15 minutes.  

8.     After the incubation period, add 400 µL 1X annexin-binding buffer, mix gently and keep the samples on ice.  

9.     As soon as possible, analyze the stained cells by flow cytometry, measuring the fluorescence emission at  530 nm (e.g., FL1) and >575 nm (e.g., FL3).

The population should separate into three groups: live cells show only a low level of fluorescence, apoptotic cells show green fluorescence, and dead cells show both red and green fluorescence. Confirm the flow cytometry results by viewing the cells under a fluorescence microscope, using filters appropriate for fluorescein (FITC) and tetramethylrhodamine (TRITC) or Texas Red® dye.

流式细胞术测定细胞周期

一、实验原理

碘化丙锭（PI）可以与细胞内DNA和RNA结合,采用RNA抑制剂将RNA消化后,通过流式细胞术检测到的与DNA 结合的PI的荧光强度直接反映了细胞内DNA 含量的多少。由于细胞周期各时相的DNA 含量不同,通常正常细胞的G1/G0期具有二倍体细胞的DNA含量(2N),而G2/M期具有四倍体细胞的DNA含量(4N),而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。因此,通过流式细胞术PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时,可以将细胞周期各时相区分为G1/G0期,S期和G2/M 期,并可通过Multicycle软件计算各时相的百分率。值得注意的是, PI不能通过细胞膜完整的细胞(如活细胞和早期凋亡细胞) ,在标本制备时,必须先用乙醇或其他破膜剂增强细胞膜的通透性,才能使PI进入细胞内与细胞内的核酸结合。乙醇通常为终浓度为70%的冷乙醇。

二、实验准备

1、试剂

胰酶、PBS、纯乙醇（4℃）、RNase A、Triton X-100

2、主要器材

    300目尼龙过滤网

三、实验步骤

1、每个样品细胞数不得少于100万。

2、胰酶消化，收集细胞（贴壁细胞）或1000rpm离心5分钟直接收集细胞（悬浮细胞）。

3、4℃ PBS洗一次，将细胞重悬于0.3ml 4℃ PBS，加入0.7ml 4℃的纯乙醇，将枪头伸入液面下，轻轻打入乙醇，轻柔混匀两次，4℃固定过夜。

4、1000rpm离心5分钟，去上清，加入染色缓冲液

PI染色缓冲液：

50 μg/ml  PI

0.1 mg/ml RNase A

0.05% Triton X-100

总体积1ml/样品，37℃孵育40分钟。

5、1000rpm 离心5分钟，小心去除上清，加入1ml PBS，轻柔混匀，300目过滤，上机检测。