Waters e2695 高效液相色谱仪实验方法

发布者:系统管理员发布时间:2019-09-02浏览次数:0

实验流程:

HPLC系统的启动准备流动相平衡色谱柱及色谱系统准备样品编辑仪器方法,开始实验清洗色谱柱及色谱系统关闭仪器


虫草素测定:

样品处理:发酵液10000rpm离心10min,取上清液稀释10-20倍进样。

色谱条件:

色谱柱:UltimateAQ-C18 (4.6×250 mm 5μm)

流动相:甲醇:10mmol/LKH2PO4=15:85

流速及运行时间:1.0 mL/min20min

二极管阵列检测器:波长254nm

柱温:30

DOX测定:

样品制备:取动物的心、肝组织,使用生理盐水洗净组织上的血液,再使用匀浆机(FastPrep-24TM5G, Shanghai boyi biotechnology co. LTD)进行匀浆。匀浆后的组织加入5mL三氯甲烷:甲醇=4:1的混合溶液,粉碎超声10min8000r/min离心10分钟,取下层三氯甲烷溶液60℃旋蒸蒸干后,加入3mL的甲醇溶液,8000r/min离心10分钟,取上清液进样。

色谱条件:

色谱柱:UltimateAQ-C18 (4.6×250 mm 5μm)

流动相:甲醇:乙腈:0.02mol/L pH>4磷酸二氢铵-冰醋酸=52:5:43

流速及运行时间:1.0mL/min20min

荧光检测器:波长:EX=246nmEM=555nm

柱温:30

ATP检测:

样品制备:收集细胞,用高氯酸溶液(0.1 mol/L)冰浴下充分匀浆,取匀浆液于414000 rpm离心10 min,取上清液重复离心一次,并用0.22 μm滤膜过滤后用于检测。

色谱条件:

色谱柱:UltimateAQ-C18 (4.6×250 mm 5μm)

流动相:30 mM 磷酸盐缓冲液(pH 6.0):甲醇=95:5

流速:0.5 mL/min10 min

检测波长:254 nm

检测温度:25

进样量:20 μL

全反式视黄酸检测:

样品制备:取小鼠腰5段脊髓于1.5ml离心管中,加入预冷生理盐水30μl,研磨杵研磨,冰上进行。匀浆后的组织加入60μl乙腈(含1%冰醋酸溶液)混合溶液,振荡30s4条件下10000g离心10分钟。吸取上清于棕色小瓶中待测。

色谱条件:

色谱柱:UltimateAQ-C18 (4.6×250 mm 5μm)

流动相:乙腈:0.1%冰醋酸溶液=86:14

流速及运行时间:1ml/min30min

检测波长:350nm

柱温:25

组胺测定:

样品制备:

衍生化条件:

a.100 μl样品溶液加入棕色EP管;

b.加入50μl 2M氢氧化钠溶液(4g氢氧化钠溶于50 ml纯水中);

c.加入200μl饱和碳酸氢钠溶液(10g碳酸氢钠溶于100 ml纯水中,超声溶解);

d.加入500μl丹磺酰氯丙酮溶液(0.5g丹磺酰氯溶于50 ml丙酮中,密封保存),涡旋混匀,40℃,避光反应60min

e.加入150μl氨水乙腈溶液(10ml氨水与10 ml乙腈混合),放置室温下30min后,4℃8000rpm离心10 min,取上清测样。

色谱条件:

色谱柱:SunFire C18 5μm 4.6×250mm

流动相:

A:0.1M醋酸铵(pH7.9);B:乙腈

洗脱程序:

Time(min)

A(%)

B(%)

0

65

35

15

30

70

25

5

95

30

5

95

31

65

35

流速及运行时间:1ml/min40min

检测波长:254nm

柱温:25