1.问：特种医学研究院光学平台具有哪些共享仪器？
答：目前光学平台拥有徕卡SP8 激光共聚焦显微镜一台，配备STED超高分辨率成像系统，HyD高分辨率检测器，显微活细胞呈像系统，可覆盖生物医学领域绝大部分样品的高分辨率成像需求。拥有徕卡DM4000B激光正置荧光显微镜，可用于组织免疫荧光成像及分析。具备大型图像处理工作站，目前运行Huygens图像处理软件，有效提高图片质量。
超高分辨率激光共聚焦活细胞系统一套（包括激光照射系统，扫描检测系统，显微镜系统，超高分辨率系统，活细胞系统，计算机系统及相关软件等）。
二、技术规格（配置）
1、激光共聚焦系统
1.1激光器：
⑴系统激光器应覆盖可见光及紫外光，各激光器单独分立；独立AOTF或DMOD调节。4个独立激光器，包含以下谱线：
近紫外激光器 405nm，50mw；
多谱线蓝光激光器 458nm，488nm，514nm,65mw；
黄光激光器 561nm,20mw；
红光激光器 633nm,10mw。
⑵激光器开闭和电压调节由计算机的激光共聚焦扫描软件系统控制，与整个系统偶合程度高，电噪声小，安全，并有良好的激光管寿命保护装置。
⑶具有激光强度回馈稳定电路设计，保证在长时间的动态记录中激光强度不会受环境的影响而改变。
1.2共聚焦扫描系统：
⑴激光扫描系统通过照相通道或荧光通道和显微镜相连，与所接显微镜一体化设计，一体化像差及色差校正，以保证高质量，高分辨率成像。软件对硬件应有效控制，使系统有优异的稳定性及可维护性。光纤耦合和镜耦合可接低功率激光器。
⑵分光器：
①多组分光镜同时支持紫外405，节省时间, 实时多色成像；
②提供独有的激光组合，改善活细胞成像条件。
⑶检测器数量
①三个荧光扫描检测器+一个透射光DIC（明场/相差/微分干涉）扫描检测器；配有1个高灵敏度检测器.
②可以升级为五个以上荧光检测器。
⑷连续分光设计系统（或其它光谱分离系统）
①三个荧光通道，一个透射光DIC通道；所有荧光通道都为光谱型荧光通道；
②光谱型荧光通道可自由更换荧光通道检测的波长范围，四个荧光通道和一个透射光DIC通道可同进行快速扫描；
③多通道荧光图像即时叠加、荧光图像与透射光DIC图像即时叠加，能精确地对光谱进行分析；
④荧光通道具有高精度的共聚焦针孔，具有宽波谱范围内的色差校正功能，能充分保证在多重荧光标记的同时检测过程中，保证每个通道扫描光切平面和厚度的一致性，并对所标记的荧光精确定位。
⑸光谱扫描功能
①高速多通道光谱分析和扫描，可获得透射光谱图像；
②光谱扫描可连续以≥1nm波长调节；
③光谱扫描范围：400-800nm；
④光谱扫描步进：1nm；
⑤高速棱镜或光栅分光，线性光谱拆分，可区分光谱大量重叠的染料；
⑥光谱数据来源：用户指定/用户自建/厂家预设。
⑹扫描速度及速度调节
①7幅/秒（512×512 pixels）；
②双向扫描速度≥3600线/秒；
③扫描速度可连续调节。
⑺共聚焦针孔一个，全自动调节型，孔径20~600微米，调节步进0.5微米。
⑻扫描分辨率及灰度级
①分辨率：≥8192×8192 pixels；
②灰度级：≥16bit。
⑼扫描方式XYZTλ任意组合，可实现点扫描、线扫描、曲线扫描、区域扫描、光谱波长扫描等。
①点扫描获取样品中一指定点的荧光强度随时间变化的点扫描图像；
②线扫描X、Y、XT；
③Xλ扫描获取一条线随光谱λ变化的线扫描图像；
④平面扫描XY横切面、XZ纵切面、XYT，任意方向旋转，200°纯光学实时旋转扫描；
⑤XYλ、XZλ扫描：分别获取横切面XY平面或纵切面XZ平面虽光谱λ变化的系列图像；
⑥XYZ，XYZT扫描任意方向；
⑽扫描旋转、光学放大（变倍）以及其他应用的要求
①转扫描：任意角度自由旋转，旋转扫描的同时可做DIC扫描；
②实时光学放大扫描：0.75X - 48X，连续可调；
③共聚焦扫描视野：22mm。
⑾可即时或延时进行扫描，扫描时间无限制，扫描时可结合ROI(regionof interesting，感兴趣区域)，实现样品中多点位置的荧光强度变化的图象、曲线和数值的实时（real time）显示。扫描速度设置多，时间扫描时可单通道或多通道同时进行。
⑿有线和帧方式的多重扫描功能可使在充分保证荧光信号通量（特别是一些弱荧光信号）的情况下，消除串色（混色）问题。同时也有利于对荧光样品的定量检测。
⒀在改变扫描分辨率及扫描速度等后，无须很复杂地对仪器参数重新设置：避免频繁重新设置扫描参数，减少样品不必要的激光照射时间，减少荧光的无谓淬灭。是荧光定量检测的根本保证（如细胞离子浓度的测定等细胞物质的定量分析）。
⒁有记忆功能，使仪器可在不同时间对样品进行同一仪器测试设置的扫描，保证样品间可靠的定量比较；可智能化取像，以便在不了解染料特性是自动取像。
⒂有专用的图象数据库：有利众多图象的浏览这种数据库不但满足对图象的浏览，而且利用上述“记忆”功能，使仪器可在不同时间对样品进行同一仪器测试设置的扫描，保证样品间可靠的定量比较，在改变扫描分辨率及扫描速度等后，无须很复杂地对仪器参数重新设置：避免频繁重新设置扫描参数，减少样品不必要的激光照射时间，减少荧光的无谓淬灭。
⒃系统要求采用模块化设计，便于整个系统的扩展和升级换代。
⒊光学系统（显微镜）
⑴采用目前最高级的全自动智能型倒置荧光显微镜，其光学部件适合于升级405nm激光；由计算机的激光共聚焦扫描软件系统全自动控制（同时也须兼顾手动）。
⑵有光强管理器装置：一方面能优化每一物镜的光亮度，同时能使物镜转换后，自动储存各个物镜各自的光强度值，不同倍数物镜的观察不需要重新调节光线亮度，使操作更加方便，同时也有利于摄像。
⑶6位电动计算机控制转换的物镜转换台；各个不同物镜转换过程中，必须能达到计算机控制的充分齐焦。
⑷所有物镜为高性能共聚焦专用
放大倍率 | 性能（平场/消色差等） | 数值孔径 | 工作距离 | 干/水/油 |
10× | 平场复消色差物镜 | ≥0.40 | ≥2.2 0 | 干 |
20× | 平场复消色差物镜 | ≥0.70 | ≥0.59 | 干 |
40× | 平场复消色差物镜 | ≥1.30 | ≥0.24 | 油 |
63× | 平场复消色差物镜 | ≥1.40 | ≥0.13 | 油 |
100× | 超高分辨率成像用平场复消色差物镜 | ≥1.40 | ≥0.13 | 油 |
⑸显微镜聚焦稳定、精确、可靠，Z轴步进最小≤1nm。
⑹高精度扫描台, 127 x 83mm,分辨率0,02-0,04μm,重复精度< 1μm
⑺显微镜除了荧光和透射光之外，还应具备相应的微分干涉相差配置。
⑻目镜系统要符合人体功能学的设计，采用大视野的目镜（10倍/视场数25mm），有利于观察者长时间和舒适的观察；荧光观察中的光学系统需要有光捕捉装置，能达到充分消除杂散光，降低背景亮度，有利于操作者的精确观察。
⑼≥4位显微镜荧光滤色片组，置换方便，覆盖紫外和可见光波长。
UV单色滤块: 激发340-380nm; 阻挡400nm; 发射: 425nm
蓝色激发单色滤块: 激发450-490nm; 阻挡510nm; 发射: 515nm
绿色激发单色滤块: 激发515-560nm; 阻挡580nm; 发射: 590nm
红色激发单色滤块：激发590-650nm，阻挡660nm，发射：664
⑽显微镜透射光源：卤素灯或LED光源。
⑾显微镜荧光光源：采用光纤导入方式以最大限度降低光源对系统的热噪声、热漂移等影响；配置最新的型号，功率大（金属卤素灯），光强度高，寿命长（2 000小时以上）。
⑿配有CO2培养孵育盒。高精度培养皿控制器，能保持培养皿中的环境恒定，温度和CO2浓度可调节。活细胞的活性可以维持≥2天。并保证延时观察中尽量小的热漂移现象，CO2浓度可保持稳定，培养箱盖板上有专用加药及显微注射孔。
4.超高分辨率系统
(1) 分辨率：xy分辨率80nm，z轴分辨率175nm，并可通过软件进一步处理得到xy方向50nm，z轴方向100nm的超高分辨率图像，可做光学切片；
(2) STED 激光：592 nm，660nm；
(3) 配置STED White 专用物镜，100× NA1.4 全光谱校正油镜；
(4) 与共聚焦共用成像控制软件，无需任何样品即可进行STED全自动校正；
(5) 配置SmartSTEDWizard模块，具有STED快速参数设置功能，可实时显示PSF；
⒋计算机工作站
高配置的品牌专业电脑工作站，CPU( Xeon)≥3.2 GHz，内存≥8GB，显卡带双显示功能，显存≥2G，液晶真彩显示屏(1个)≥32吋，2560 x 1440，硬盘≥2 T，16xDVD+/- RW刻录，Windows 7 Professional (64 位)操作系统，标准配置计算机工作站桌。
⒌软件系统
建立在Windows 7系统上，使用先进程序语言，程序执行效率高，快，稳定。整个系统程序，包括控制，检测、分析功能设计合理，操作界面友好，操作简便。
⑴控制硬件的软件功能：
①控制电动显微镜；
②选择激光波长，调节激光强度；
③拍摄2-5维图像；
④选择光谱拍摄范围，分辨率，实验条件实时记录、一键式恢复。
⑵应用软件功能（图象处理、数据分析、生物学应用等）：
①多通道叠加，三维重建，旋转，生成AVI文件，Average拍摄模式提高信噪比；
②荧光强度动态分析，动态显示，Ratio值测量（钙离子等）；2
③具有专业的FRAP（荧光漂白），FRET（荧光共振能量转移），专业电生理软件包；
④在线光谱拆分，自定义染料光谱数据库，背景扣除；
⑤图像调节：2D及3D功能
⑥具有逆卷积功能
⑦有自动聚焦功能；
⑧具有荧光亮度校正、补偿功能（在Z轴方向上补偿荧光亮度的变化）：AOTF、GAIN和AOTF+GAIN三种模式；
⑨具有环境控制功能
⑩光谱分析具有多种方式选择，支持盲法拆分，方便用户使用；
⒍仪器工作环境和仪器抗震动稳定性保证：
⑴仪器电源两个独立220V AC ±10%，50-60Hz，1000VA。
⑵工作环境温度和湿度要求温度10-35℃。相对湿度30℃时<65%。
⑶共聚焦显微镜专用防震台。
⑷不间断电源1个。
2.问：哪些人能使用特种医学研究院光学平台的仪器？
答：我们主要对南通大学特种医学研究院经系统培训的研究生、职工开放，也对校内其他院系，其他高校及机构的人员实行限时代拍服务。
3.问：我该怎么预约实验时间？
答：本所经培训的教工及研究生科通过qq群预约后使用，其他院系通过校大型仪器平台预约。
4．问：我如何取消自己的预约？
答：所内人员取消预约需提前一天在qq群内申请并获批；外单位人员必须至少提前一天取消所预约的实验，请致电 855003377取消实验。
5.问：我该如何参加培训课？
答：由于仪器设备的复杂性，本单位的培训为系统化的定期培训及考核。外单位如需参加培训，则所有的培训都采用付费一对一的方式。需要参加培训的实验者请与负责人王雪婷联系，或者电话预约（855003377）。我们建议实验者首先建立一个针对自己实验标本的有效的染色方法，在此基础上请自带一个荧光标记标本参加培训。
6. 问：培训课上，我应该带些什么？
答：需要带一个荧光标记完好的标本。这意味着在培训课之前，你必须建立好你的染色方法和预先观察你的标本。请确认标本的信号足够强（很容易看到）、背景足够黑。我们的共聚焦显微镜系统是建立在徕卡的倒置显微镜和正置显微镜上，所以标本必须是如下：
标本在载玻片上固定好并且必须用盖玻片封片。而且，盖玻片的型号只能用 1 号或者 1.5 号。
使用单层盖玻片封底的槽或者培养皿。
激光扫描共聚焦显微镜实验方法
问：什么是激光扫描共聚焦显微镜实验方法？
答：在传统的荧光显微镜中，一定波长的激发光被分光镜反射、通过物镜照亮标本，标本发出的荧光通过物镜被分光镜反射至目镜，被眼睛看到。使用传统的荧光显微镜观察厚标本的主要问题是：侧向干扰（同一平面发出的荧光）和轴向干扰（不同平面发出的荧光）。
激光扫描共聚焦显微镜通过两种方式分别排除了传统荧光显微镜观察厚标本时发生的侧向干扰和轴向干扰：1）用一个聚焦的光束点扫描标本，由于单一时间标本上只有一个点被激发光照射，因此排除了侧向干扰； 2）在光检测器前设置一个可以改变大小的针孔，使标本焦平面以外的发射光不能到达检测器，因此排除了轴向干扰。
问：激光共聚焦显微镜比传统的荧光显微镜更容易漂白标本吗？
答：荧光标记标本的漂白是荧光显微镜的一个主要问题。与传统的荧光显微镜将标本处于低能量和宽光束的激发光中相比，激光扫描共聚焦显微镜由于使用高能量和聚焦的光束，所以会增加标本的漂白。但是使用激光扫描共聚焦显微镜在采集图像时，每次只照射标本上一个微小的区域，并且照射时间很短，所以又减少了标本的漂白。
问：当我通过目镜观察时很难找到自己的标本时，有特别的技巧使我能更容易的找到标本吗？
答：请核对以下几点：
确定分光器被选择在目镜的位置上，并有光照射在标本上。
如果使用的是汞灯，确定你选择了正确的荧光滤片。
确定标本的方向放置正确， 盖玻片应该朝向物镜。
如果你使用的是油镜，确定在物镜和盖玻片之间有足够的油，并且没有气泡。
一边移动平台一边观察，因为眼睛更容易看到移动的物体。
问：为什么我的标本聚不上焦？
答：显微镜的高倍镜都有高的数值孔径（达到1.4）和很短的工作距离（100–200微米），所以标本必须靠近物镜。最常见的问题如下：
1． 盖玻片厚度不合适，高倍镜无法“穿透”盖玻片到达标本。
改进 – 使用 #1 或者 #1.5 盖玻片。
2．细胞种在载玻片上，使用封片剂封好，然后盖上盖玻片。如果使用了过多的封片剂，造成标本过厚，也可能使物镜无法聚焦到标本。
改进 - 用较少的封片剂，或者把细胞种在盖玻片上，然后固定在载玻片上。
3．如果细胞种在有垫圈的槽里，而在固定标本的时候垫圈未去掉，也会使得物镜离标本太远。
改进 – 把垫圈去掉或者将细胞直接种在有盖玻片底（取代载玻片底）的槽里。
普通显微镜方法
问：我怎样固定一个用于显微镜观察的厚标本并且不损坏它？
答：你需要将盖玻片垫高，至少要达到标本/细胞的高度。有多种方法可用，例如：
1．用胶布（透明胶，电工胶）在载玻片和盖玻片之间做一个“步距”。
2． 从胶布的中间剪出一块小的面积作为标本池，将标本放入中间的池中，盖上盖玻片封好。
问：我能固定 GFP 标记的标本吗？
答：GFP 的荧光会经脱水或者乙醇和丙酮固定而衰减，这些固定方法可能改变了 GFP 分子的性状。有研究报道，GFP 经甲醛固定后，荧光信号会大大减弱；标本长期放置在乙醇中会消弱 GFP 信号，并增强自发荧光。但是也有其他研究报道，用多聚甲醛（4% 缓冲液，固定 1 小时）可以成功地固定了转 GFP 的酵母细胞，荧光信号没有减弱。因此，你可以用低浓度的多聚甲醛，尽可能短时期地固定（对于细胞约 5~10 分钟）。标本可以放在甘油封片剂中（约含 90% 的甘油）。
注意：如果你的 GFP 是可溶性蛋白，会因为去垢剂的破膜丢失所有的信号。
据报道用指甲油封片可以导致 GFP 信号的丢失（因为指甲油中的乙酸乙酯/丙酮成分）。有报道以下方法可以用于封片：a) Almay Crème（hypo-allergenic，"Canyon" shade）; Wet 'n Wild's" Clear Nail Protector " 不含甲苯/甲醛（固定在苯二胺的甘油溶液中）; b) 融化的石蜡：简单的办法就是将石蜡加热融化用作封片剂。
使用活体组织和活细胞采集GFP信号， 可以获得最好的图像。
问：抗荧光淬灭剂的作用是什么？
答：当荧光染料暴露在激发光下时，几乎都有漂白的现象（光漂白）。光漂白和以下因素有关：1）照射光的强度；2）照射光的照射时间；3）其他影响荧光强度和荧光漂白的因素有pH、培养介质的性质，其他荧光淬灭的物质存在。
一种染料的光子产量代表染料被完全光漂白之前的激发周期的平均次数。平均光子产量是荧光量子效率（Qf）和漂白量子效率（Qb）的比。例如：荧光素对光很不稳定，在碱性溶液中 Qf /Qb 大约为 30K。Qf 和 Qb 都属于染料的性质，受染料环境的影响很大。主要影响 Qb 的因素是活性氧和自由基类物质。
一种抗荧光淬灭剂的主要目的是保持染料的荧光，使标本能用于更长时间的观察。抗荧光淬灭剂通常是通过抑制活性氧的产生和扩散来达到这一作用，因此降低了Qb，Qf并没有伴随着降低，荧光仍然保持不变。
问：推荐使用哪些抗荧光淬灭剂？
答：一些常用的和最有效的抗荧光淬灭剂的优缺点比较如下，也提供了部分的商业来源以及共聚焦显微镜用户的意见和评价。
1．p-phenylenediamine (PPD)
尽管它是最有效的抗淬灭剂之一，但对光和热都有较强的敏感性，而且具有毒性，后者也限制了在体内研究的应用。Krenik等（1989）建议最理想的 PPD 抗淬灭剂混合液配方是：90% 甘油、10% PBS，其中PPD 的浓度在（2~7）mM 之间，最终pH值为 8.5~9.0。
2．n-propyl gallate (NPG)
NPG 无毒性，对光和热稳定，但抗漂白效果不如 PPD，可用于体内研究。推荐浓度在（3~9）mM，用甘油配置效果也不错。配置的方法在FAQ的后部分。
3．1,4-diazobicyclo[2,2,2]-octane (DABCO)
DABCO是一种不电离的、稳定的抗淬灭剂，价格便宜而且容易使用。配置方法在 FAQ 的后部分。
4．Ascorbic acid (VitaminC)
5．Vectashield
公司描述：具有在显微镜观察中阻止荧光的丢失并在长期储存过程中保持抗荧光淬灭的能力。抑制荧光素的漂白，例如：TexasRed , Rhodamine , AMCA 和其他的荧光染料。特别的是，比甘油缓冲液、聚乙烯醇固定液或者其他含有普通抗荧光淬灭剂的固定液更加稳定，光学清晰度更高。
Vector Laboratories, Inc.
30 Ingold Road,
Burlingame, CA 94010 USA
Tel：(415) 697-3600
Fax： (415) 697-0339
6．SlowFade
公司描述：SlowFade 的原始配方(S-2828)可将荧光素的荧光淬灭速率减小到零。尤其适用于激光扫描共聚焦显微镜的定量测定，因为其在测定时往往要求激发光强度较强，而且采集时间也较长。SlowFade 试剂可使荧光素的有效荧光发射扩大 50 倍以上，用该试剂封片后，细胞和组织中的荧光信号可保持两年之久。原始的 SlowFade 配方实际上可使荧光素的荧光完全淬灭，也可使 Cascade Blue和 Alexa Fluor 350 荧光团的荧光几乎完全淬灭。
Molecular Probes, Inc.
P.O. Box 22010 Eugene, OR 97402-0414 USA
Tel：(503) 465-8300
FAX： (503) 344-6504
7．SlowFade Light
为了克服上述的局限，分子探针公司的研究人员又研制了 SlowFade Light 抗荧光淬灭试剂盒。该抗荧光淬灭剂的配方使荧光素的淬灭速率降低 5 倍，而荧光素的初始荧光强度没有显著降低，因此使光学显微镜的信噪比显著提高。此外，对Cascade Blue, Alexa Fluor 350, tetramethylrhodamine 和Texas Red 的淬灭也达到最小。实际上，SlowFade Light 抗荧光淬灭剂试剂盒可将 Cascade Blue 的淬灭速率几乎降到零，而其发射强度仅降低约 30%。
问：DABCO抗荧光淬灭封片剂的配方是什么？
答：
DABCO 储藏液
1．在 60℃ 下，溶解 2 克 DABCO（抗荧光淬灭剂）于 90ml 甘油中，15-30 分钟。
2．加 10 ml 1M Tris-HCl，pH 7.5
3．用 5M HCl 调节 pH 值到 8.0
4．冷却到室温
5．加 100 ml 20% thimerosal（溶解于水）
6．可选：加 50 ml PI （储液：溶于水的 1mg/ml PI ）
7．4℃ 于棕色瓶或箔纸包裹的瓶子中避光保存
缩写：
PI = propidium iodide
PI – 激发光与发射光与罗丹明相似 – 用 488 nm 或者 514 nm 的激发光 – 长通 570 nm 或者 600 nm 的发射滤片
DABCO = 1,4-二偶氮双环[2,2,2]-辛烷
Ordering (Sigma) ：
D2522 DABCO, 25g
T5125 thimerosal, 10g
P4170 PI, 10mg
问：N -丙基没食子酸盐（n-propyl gallate ，NPG）抗荧光淬灭封片剂的配方是什么？
答：
溶于甘油的 5%N -丙基没食子酸盐
1．于 50 ml 试管中，加 5% N -丙基没食子酸盐到 25 ml 甘油中
2．摇晃混合过夜（室温或者 4℃）
3．使用之前静置一天，让溶液中的气泡跑掉
4．4℃ 于棕色瓶或箔纸包裹的瓶子中避光保存
问：采集的信号很弱，我该怎么办？
答：决定图像质量的最重要的因素是标本质量。好的染色过程可以使图像具有强的信号和完全黑的背景。以下列举了部分的方法用来检测你的染色是否是最佳的：
厂商在他们的指南中经常会有“最佳稀释法”，你不能相信这个方法适合于所有的标本制备的方法。最好的办法是对一抗和二抗做一个梯度稀释，测定哪个稀释浓度处理的标本信号最好，背景最低。
尽量调整好阻断的步骤（改变阻断溶液的成分和洗脱时间）。如果样品要用甲醛固定，请确定不含游离的乙醛。有些调整是硬件方面的（光强或者检测的灵敏度），在信号很弱的标本上做硬件的调整，经常会导致背景很高。